应用 DHPLC筛查BRCA1和BRCA2基因特异性变异
Identification of Specific BRCA1 and BRCA2 Variants by DHPLC
Human Mutaton 16:345-353(2000)
摘要： DHPLC作为一个 遗传性改变的可靠分析工具越来越受到临床遗传学家的关注。本研究的目的是为了定性研究 BRCA1和BRCA2基因的变异，而优化PCR引物设计及DHPLC的分析条件。BRCA1和BRCA2基因显示高频率的多态，通过测序来鉴定区别肿瘤相关突变和良性变异依然耗时和昂贵。而DHPLC分析形成的特异性色谱图和特异性的序列改变相对应。本文研究了应用DHPLC检测白种人群高频率发生的特异性多态的灵敏度。对BRCA1全基因和BRCA2部分基因进行了检测，结果从432个BRCA1基因杂合突变中检测出了431个，其中18个突变是以前未研究过的，可能属于新的突变或是罕见的多态。而从137个BRCA2基因简单序列变异中正确检测出了135个，其中6个突变是以前未研究过的，可能属于新的突变或是罕见的多态。
比较直接测序， SSCP和DHPLC技术进行BRCA1基因的 突变分析
A comparison of BRCA1 mutation analysis by direct sequencing SSCP and DHPLC
Hum Genet(1999) 105:72-78
摘要： 通过对病人进行基因筛查预测特定癌症风险，直接测序法是最灵敏的技术，但复杂基因的测序技术要求高，费用昂贵和耗时。我们测试了其他的方法来对 BRCA1基因在测序前进行筛查，以便发展一种快速和灵敏的方法。对BRCA1基因直接测序非常费劲，因为该基因缺乏明显的突变热点。单链构象多态分析技术（SSCP）是最常用的预先基因筛查技术，但其灵敏度和特异性不能完全满足要求。我们比较了SSCP技术和新发展的变性高效液相色谱技术（DHPLC）对BRCA1基因突变筛查能力。我们分析了23例高风险早发乳腺癌和卵巢癌病人和4例对照。在这些病例中，共有113个BRCA1基因的片段含有序列变异。DHPLC分析100%检测到了测序发现的变异，相反，SSCP只检测到了94%的变异。另外，DHPLC分析还能因为不同分子的洗脱峰的特性不同而区别同一片段上不同的变异。 样品中的多态也可以通过 DHPLC分析来预测而不需测序。结论，DHPLC是一种高性能进行遗传分析的筛查方法，它具有高 灵敏度，高效率，高性价比，和自动化的优点。
变性高效液相色谱技术检测遗传性非息肉性结直肠癌 (HNPCC) 的 hMLH1
和 hMSH2 基因
DHPLC mutation analysis of the hereditary nonpolyposis colon cancer (HNPCC) gene hMLH1 and hMSH2
J.Biochem.Biophys.Methods 47(2001)21-32
摘要： 变性 高效液相色谱技术（ DHPLC）是一种 有效地检测单个碱基或几个碱基 突变的技术，已成功应用于多种疾病相关基因的突变检测。结直肠癌是最常见的肿瘤之一，而且遗传性非息肉性结直肠癌 (HNPCC) 的 hMLH1和hMSH2 基因也主要是发生点突变。测序被认为是一种高灵敏的筛查方法，但该方法耗时和昂贵。因此我们决定用一组德国 HNPCC病人样本检测DHPLC的灵敏度和重复性，这组样本经测序检测已证实在 hMLH1和hMSH2 基因上有 74个变异。PCR产物的DHPLC分析条件由扩增序列的熔链温度决定。结果DHPLC检测到了74个变异中的73个，灵敏度为97%，而特异性为100%。结论，DHPLC技术是一种性价比高，快速，灵敏和特异地检测 HNPCC 的hMLH1 和hMSH2基因的方法。因为该技术是一种使用简单，劳动强度不大的突变筛查技术，这种技术无疑将应用到许多疾病基因的检测，特别是那些引起家族性肿瘤的基因。应用DHPLC技术可以经济和快速地对大量的病人进性筛查。
变性高效液相色谱技术检测卵巢癌组织 p53基因突变
Mutation analysis of p53 in ovarian tumors by DHPLC
J.Biochem.Biophys. Methods 47(2001) 73-81
摘要： 迄今， 卵巢癌仍是妇女健康所面临的重要问题，因为卵巢癌在妇科肿瘤的死亡率最高。很大部分的卵巢癌组织中 p53基因发生突变，而且有证据表明p53蛋白失活的病人预后不良和对化疗不敏感。 我们采用半变性 高效液相色谱技术（ DHPLC）分析 卵巢癌细胞以建立一种快速和敏感的检测 p53基因突变的方法。我们设计了7对引物扩增p53基因的编码序列，对每个扩增片段杂合双链的DHPLC检测条件进行了优化。结果在45例卵巢癌组织样本中检测到了17个遗传变异（38%）。另外，通过与肿瘤组织进行比较，在正常组织中常见的多态位点可以作为快速检测肿瘤组织杂合性丢失（LOH）的手段。我们观察到内含子2和3的LOH与一个突变片段的一个等位基因丢失符合良好。结论， DHPLC筛查技术证明是一种灵敏和有效地进行 肿瘤组织 p53基因突变检测技术。由于p53基因突变预示多种肿瘤病人预后不良，快速检测肿瘤组织中的遗传变异可能为病人的个体化治疗提供依据 。
变性高效液相色谱和短荧光片段定量多重 PCR技术全面筛查 RB1基因突变
Comprehensive Screening for Cnstitutional RB1 Mutations by DHPLC and QMPSF
Human Mutation 23:193-202(2004)
摘要： RB1 基因的突变与视网膜母细胞瘤的发病易感性相关，检测这些突变对为视网膜母细胞瘤病人提供合适的遗传咨询很重要，但是这种检测面临着极大的挑战，因为绝大部分突变都是独特的，并且分布在整个基因编码序列上。从2001年开始，我们将RB1 基因的检测纳入为常规视网膜母细胞瘤病人临床处理的基础检测。由于多种突变筛查技术都不能满足有效筛查RB1基因突变的要求，我们发展了一种联合方法，即采用半自动的变性 高效液相色谱技术（ DHPLC）筛查点突变，采用 短荧光片段定量多重 PCR技术 (QMPSF) 检测基因重组。我们用这种方法对 192例不相干的 视网膜母细胞瘤病人的全基因外显子和启动子序列进行了突变筛查，病例大多数为法国人。在 102例双侧或家族性病例和90例单侧散发性先证者中，检测到的突变分别为 83 例(81.5%) 和5例 (5.5%)。其中43种突变以前未见报道。突变谱与以前的报道显著不同，表现为大量的剪接突变和大片段缺失。本研究显示DHPLC研究RB1突变非常可靠，但同时需要有检测缺失突变的技术进行配合。最后，鉴于我们的检测方法的可行性，考虑到 视网膜母细胞瘤病人的利益，应该将 RB1 基因的检测纳入为常规健康检测中。
应用 DHPLC筛查乳腺癌病人ATM基因突变和多态
Screening Breast Cancer Patients for ATM Mutations and Polymorphisms by Using Denaturing High-Performance Liquid Chromatography
Environmental and Molecular Mutagenesis 38:200-208(2001)
摘要： 本文应用 DHPLC筛查 了 52例 乳腺癌病人 ATM基因的全部62个外显子和外显子两侧 10–20bp的内含子序列，检测DNA碱基序列变异。在6例(12%)病人中共新发现了8种不同的生殖系突变，而非常见的多态。其中3例含有4种非保守的错义突变，另外3例含有2种保守的错义突变和2种同义突变。另外，在43例病人中发现了141种DNA序列变异，包括21种常见多态和少见的变异。通过比较新发现的突变与人群和癌症的表型的关系发现，非洲裔美国人(3/7= 43%)与其它种族间(3/45 =7%,P= 0.026)存在显著差异，其它特性与突变状态无关。
结直肠癌病人癌胚抗原基因突变及在肝转移中的作用
Mutations in the Carcinoembryonic Antigen Gene in Colorectal Cancer Patients:Implications on Liver Metastasis
Cancer Research 61:2822-2826,April 1,2001
摘要： 癌胚抗原基因（ CEA）表达在临床上常常用来监测结直肠癌和其它癌症，但是部分病人异常高的CEA不能单独用肿瘤负荷来解释。我们在8例含高水平CEA的病人中，发现3例的CEA突变 (PELPK 基序) 与肝清除有关。我们应用变性高效液相色谱检测这些病人的基因多态，测序证实为杂合突变。 PELPK基序突变在实验动物中显著降低循环系统的清除速率，该区域不含突变的病人表现为正常的清除速率。PELPK 的突变可能影响蛋白结构稳定性以及与肝中 Kupffer细胞受体的结合的亲和性。这一结果暗示CEA促进癌的肝转移。 |