DHPLC技术在基因甲基化分析中应用

Methylation of p16 CpG Islands Associated with Malignant Transformation of Gastric Dysplasia in a Population-Based Study

Clinical Cancer Research Vol. 10, 5087–5093, August 1, 2004

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Methylation of CpG islands of p16 associated with progression of primary gastric carcinomas

Laboratory Investigation (2006) 1–8

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DHPLC技术分析印迹基因差异性甲基化区域的DNA甲基化

摘要：亚硫酸盐处理后的基因测序是甲基化分析中应用最广泛的技术，即异质性DNA经PCR同时无偏性扩增甲基化和非甲基化序列后的测序分析。但是，这种技术需要劳动强度大，耗时的克隆和测序步骤。本研究中，我们应用变性高效液相色谱技术（DHPLC）作为亚硫酸盐处理后的基因测序技术的补充，分析印迹基因差异性甲基化区域（DMR）的DNA甲基化。结果表明DHPLC技术能可靠和可重复的分析人SNRPN, H19, MEST/PEG1, LIT1, IGF2, TSSC5, WT1等印迹基因，小鼠eH19, Mest/Peg1,Igf2R等印迹基因DMR的整体甲基化样式。DHPLC分析形成的甲基化样式图与亚硫酸盐处理后的基因测序的结果一致，并可以用来作为甲基化样式的“指纹图”，显示异质性样本中DMR的整体甲基化样式。结论：亚硫酸盐处理后基因组DNA，经PCR同时无偏性扩增甲基化和非甲基化序列，然后进行DHPLC分析，能提高印迹基因甲基化分析的通量。

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一种新的MSP/DHPLC方法分析印迹基因甲基化状态：低嵌合水平的细胞的分子检测

A Novel MSP/DHPLC Method for the Investigation of the Methylation Status of Imprinted Genes Enables the Molecular Detection of Low Cell Mosaicisms

HUMAN MUTATION 17:423.430 (2001)

摘要：我们介绍了一种新的方法分析印迹基因甲基化状态，该技术基于甲基化特异的PCR扩增，然后进行变性高效液相色谱(MSP/DHPLC)分析。该方法是一种快速和可靠的甲基化分析技术，可作为传统甲基化分析方法，如South杂交，甲基化特异的PCR（位点特异的MSP）等技术另一种选择。通过分析2个人印迹基因SNRPN和LIT1(KCNQ1OT1)，对该技术在差异性甲基化等位基因的分辨率的性能进行了检验，这2个印迹基因的异常分别与Angelman/Prader-Willi和Beckwith-Wiedemann综合征相关。MSP/DHPLC方法基于PCR扩增亲本特异性甲基化的基因片段，首先用亚硫酸盐处理基因组DNA，然后用与修饰DNA匹配的引物进行扩增。两个等位基因理论上扩增效率一样，并且扩增的片段大小也一样，但是，其序列在多个位点上不同，DHPLC能有效地分离这两种分子群体。MSP/DHPLC方法的高灵敏度和定量特性表现在能检测婴儿中母本单亲15号染色体的二体的低嵌合水平的细胞（/Prader-Willi综合征）。这一小群细胞（约8%）用常规方法检测不到。而检测带有染色体结构异常的低嵌合水平的细胞通常采用细胞遗传学方法，MSP/DHPLC方法不仅提供了分子水平检测的手段，并且还能检测在染色体结构上完整的嵌合体。

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变性高效液相色谱技术(DHPLC)作为癌组织中基因启动子异常甲基化的可靠和高通量的预筛方法

Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC) as a Reliable High -Throughput Prescreening Method for Aberrant Promoter Methylation in Cancer

HUMAN MUTATION 23:612^620 (2004)

摘要：启动子区CpG岛异常高甲基化是癌组织中肿瘤抑制基因（TSG）表达沉默的常见和重要机制。大规模表达谱的研究使表达下调的潜在TSG基因越来越多，需要高通量的技术筛查他们的高甲基化水平。本文建立了DHPLC作为可靠和高通量筛查分析技术。本研究中，用甲基化样式已经明确鉴定，且具有不同甲基化样式的CDKN2A/p16基因启动子区的DNA为研究对象，建立了DHPLC预筛技术鉴定CpG岛甲基化。即亚硫酸盐处理基因组DNA后，PCR同时扩增CDKN2A/p16基因启动子区甲基化和非甲基化序列，接着对PCR产物进行变性和复性处理以形成异源双链供DHPLC分析。所有CpG岛均甲基化的DNA将形成一个滞留时间改变的单峰（同源双链），而部分CpG岛甲基化的DNA还将形成代表不同异源双链结构的峰信号。该方法建立后，对35例原发膀胱癌和乳腺癌的样本进行了盲法分析，结果显示8例病人的p16基因启动子完全或部分甲基化，1例病人杂合突变。结论：DHPLC技术是方便和高灵敏的甲基化筛查技术。