DHPLC 进行 β -珠蛋白基因突变筛查的可靠性
Reliability of DHPLC in mutational Screening of β -Globin(HBB) Alleles
HUMAN MUTATION 19:287-295(2002)
摘要： 遗传性血红蛋白疾病代表了世界范围内最常见的孟德尔遗传疾病，该病在地中海，亚洲，非洲，和印度高发。 β -珠蛋白基因上200多种突变是引起血红蛋白病理和β地中海贫血综合征的原因。该疾病的防治措施基于在高危人群中，在产前或出生后对杂合性携带者或病人进行基因诊断，这就需要一种可靠的突变筛查方法。 我们基于 变性高效液相色谱（ DHPLC）技术 发展了一种快速和 的高特异的突变检测方法。为了评估该方法的灵敏度和特异性，我们应用 DHPLC技术筛查了30例正常意大利人和40例 杂合性携带者样本，以前通过多重 ARMS技术已证实这些携带者样本的β-珠蛋白基因含有25种不同的突变。结果显示DHPLC分析的 灵敏度和特异性都是 100%。所有以前证实了的25种突变和2种以前未检测到的多态都准确检测出来了，既无假阳性也无假阴性。另外，我们还成功检测到了12种复合的杂合突变和4种纯合突变。总之，该方法能快速检测最常见的 β -珠蛋白基因突变，这些突变约占97% 意大利人群的 β -珠蛋白基因突变。与经典的突变筛查技术比较，该方法快速，高灵敏，性价比高，并且能半自动化地对大量的样本进行筛查。
变性高效液相色谱 (DHPLC)全面和快速分析囊性纤维化疾病的膜转导调节因子（CFTR）基因：遗传咨询中的应用
Complete and rapid scanning of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator(CFTR) gene by denaturing high-performance liquid chramatograpgy (D-HPLC): major implications for genetic counseling
Hum Genet(2001) 108:290-298
摘要： 目前发现膜转导调节因子（ CFTR ）基因有 900 多种突变和 200 多种多态。虽然 CFTR 已被克隆了十年，但是全面扫描其所有 27 个外显子的已知和未知突变仍然面临技术上的挑战。快速准确检测突变对于囊性纤维化疾病（ CF ）高危家系的产前诊断以及理解基因型和表型之间的关系非常重要。本研究报道了成功应用变性高效液相色谱（ DHPLC ）技术全面和快速分析 CFTR 基因的所有编码序列。我们用 27 对引物扩增了所有编码序列，优化了每个扩增产物的分析温度，并且用 1552 例来自法国和其它欧洲国家的 CF 病人的样本进行了验证，这些样本以前证实在该基因的所有的熔链域都含有 突变或多态。 DHPLC 分析检测到了 415 个以前经 变性梯度凝胶电泳和测序检测的 突变和 74 个新突变，这种新技术对筛查 DNA 序列变异非常准确（迄今对 CFTR 等为基因的检测为 100% ）和快速（对 CFTR 全基因的检测不到一周）。 DHPLC 分析技术将会减少群体中未分型的 CF 等位基因，从而降低高风险 CF 配偶中剩余的 CF 风险。这种技术不仅对 CF 病人很重要，并且对其它具有多位点，高频率突变的基因检测也非常有意义。
遗传异质性疾病的突变筛查： DHPLC技术和DNA测序技术对引起腓骨肌萎缩症的多种基因的突变的检测比较
Screening for mutations in a genetically heterogeneous disorder:DHPLC versus DNA sequence for mutation detection in multiple genes causing Charcot-Marie-Tooth neuropathy
Genetics in Medicine Sept./Oct. 2001.Vol.3No.5, 335-343
目的： 以 腓骨肌萎缩症（ CMT）为模型，评估变性高效液相色谱（DHPLC）技术进行遗传异质性疾病突变筛查的效率。 方法： （1）以 PMP22，MPZ，GJB1和EGR2基因中已知的50个序列变异为研究对象，优化DHPLC进行突变筛查的条件；（2）比较 DHPLC技术和DNA测序技术检测168例病人样本中的突变。 结果： 我们建立了 DHPLC技术检测PMP22，MPZ，GJB1和EGR2基因突变的最优条件，在此最优条件下，DHPLC技术和DNA测序技术一样灵敏，并且DHPLC技术检测到了2个测序未检测到的突变。 结论： DHPLC技术提高了 遗传异质性疾病突变筛查的效率和灵敏度。
DHPLC技术检测不相关的腓骨肌萎缩症病人中 MTMR2基因突变 提示其在遗传性神经性疾病中发生低频率突变
Denaturing High-performance liquid chromatography of the myotubularin-related 2 gene(MTMR2)in unrelated patients with Charcot-Marie-Tooth disease suggested a low frequency of mutation in inherited neuropathy
Neuagenetics(2001)3:107-109
摘要： 腓骨肌萎缩症 4B (CMT4B) 是一种常染色体隐性遗传的脱髓鞘型神经性疾病，表现为周围神经系统 的髓磷脂鞘的错误折叠，与定位于染色体 11q22的MTMR2基因突变相关。为了研究MTMR2基因突变是否引起其它形式的CMT，我们用DHPLC技术筛查了183例表型差异分布广泛的 不相关的 CMT病人中 MTMR2基因突变，我们检测到了4个常见突变和3个罕见外显子突变,其中2个罕见突变在2个 不相关的先天性 低髓鞘化神经病 病人中检测到 ,而在正常人中未能检测到。我们的结果提示MTMR2基因功能丧失的突变主要与CMT4B亚型相关。
DHPLC分析甲型血友病的评估
Evaluation of DHPLC in the analysis of hemophilia A
J.Biochem.Biophys. Methods 47(2001)39-51
摘要： 甲型血友病是一种常见的遗传性出血性疾病，由因子 VIII (FVIII)基因的突变引起。目前已经发现了FVIII基因大量的不同突变，这些突变为临床上病人表型的各种显著差异提供了遗传学基础。对于特定突变的了解可能有助于遗传咨询，以及预测抗FVIII抗体产生的风险这种目前 甲型血友病治疗中最严重的并发症。鉴于该基因相当大（ 7.2 kb的编码序列，26个外显子），突变检测面临技术上的挑战，常规的突变筛查方法，如变性梯度凝胶电泳和单链构象多态分析都只能部分满足要求。这些技术耗时，需要特定的经验，突变检出率只有70–85%。相反， 变性高效液相色谱（ DHPLC）技术提供了一种非常有前景，快速和灵敏分析PCR扩增产物的新方法。为了证实DHPLC技术对甲型血友病进行分子诊断的可行性，我们首先对156例以前证实含有 FVIII基因突变 的队列进行了检测。通过经验确定每个外显子的熔链曲线， DHPLC分析很容易检测到了150个突变 (96.2%)。5个突变(3.2%)通过对特定的核苷酸变化进行分析温度优化后也检测到了。1个突变(0.6%)未能检测到。然后我们对27例经变性梯度凝胶电泳和化学错配切割分析为阴性的 血友病 病人进行 DHPLC分析，在19例病人中检测到了引起疾病的突变。
变性高效液相色谱结合直接测序检测肌营养不良基因突变
Detection of mutations in the dystrophin gene via automated DHPLC screening and direct sequencing
BMC Genetics 2001,2:17
背景 : 目前的分子诊断实验室对 杜兴肌营养不良（ DMD）疾病的诊断 主要集中在对 大片段缺失和重复（一个或多个外显子）的检测，这些突变约占 DMD病因的65%，通过已经存在的多重PCR引物进行检测。由于该基因非常大（79个外显子），对于点突变（碱基替代，涉及一个或几个碱基的缺失和重复）的检测既昂贵又耗时。本研究的目的是发展一种有效和方便的方法，在有限增加费用的基础上，检测所有或绝大部分肌营养不良基因的突变。
结果 : 采用 变性高效液相色谱技术对 8例DMD病人的肌营养不良基因的86个扩增产物进行筛查，这些病人经检测发现大片段的重组为阴性。结果在6例病人中发现了可能引起疾病的突变。对2例检测为阴性的病例的所有86个扩增产物测序，只发现了几个多态位点。
结论 : 我们的研究表明现在临床实验室同时开展 肌营养不良基因的 点突变和大片段缺失 /重复的检测工作是可行的。 只需要有限增加费用，突变检出率就可由 65% 上升到 92% 。
变性高效液相色谱：家族性肥厚型心肌病的高通量突变筛查
和运动神经原病的 SNP基因分型
Denaturing high performance liquid chromatography: high throughput mutation screening in familial hypertrophic cardiomyopathy and SNP genotyping in motor neurone disease
目的： 评价 变性高效液相色谱（ DHPLC）技术在下述两方面作为高通量筛查工具的实用性：（1）家族性肥厚型心肌病（FHC）DNA突变筛查；（2）散发性运动神经原病（MND）中单核苷酸多态（SNP）的发现和确认。
方法： 应用 DHPLC对150例FHC病人 心肌 β-肌球蛋白重链基因（MYH7）的外显子及内含子与外显子交界处序列进行突变筛查和检测。对140例散发性MND病人脊髓灰质炎病毒受体基因的 A67T位点的SNP进行基因分型。所有DHPLC阳性结果都采用常规技术进行确认。
结果： 在 35天的时间里，对MYH7基因10 kb的序列进行了突变筛查，共包括5700个扩增产物，进行了6750次DHPLC分析。在14%的FHC病例中发现了致病性突变，包括7个新发现的错义突变(L227V, E328G, K351E, V411I, M435T, E894G, 和E927K)。在两种分析温度下对MND病人和280例对照人群的A67T位点的SNP进行基因分型，结果发现这个编码SNP在MND病人中的频率(13.6%)比对照人群(6.8%)高，而且DHPLC技术还在MYH7基因和 脊髓灰质炎病毒受体基因中分别检测到 19和2个SNP。
结论： DHPLC技术是一种高通量，高灵敏，高特异和高效能的DNA变异检测技术平台，用于检测致病突变和SNP。它能快速准确的对大片段的基因组进行筛查。
DHPLC分析进行糖元贮积症的产前诊断
Prenatal diagnosis of glycogen storage disease type 1b using
Denaturing high performance liquid chromatography
Prenat Diagn 2000;20:765-768
摘要： 糖元贮积症 1b型（GSD1b）是一种常染色体隐性遗传的先天性代谢异常，由葡萄糖-6-磷酸转位酶 (G6PT1) 的异常引起。目前实验室诊断 GSD1b是建立在对新鲜和去污剂处理的肝匀浆组织的葡萄糖-6-磷酸酶的酶功能分析上。这种分析需要肝的活检组织，而采集胎肝活检组织的高损伤使得该方法在日常临床上并不可行。最近， G6PT1基因已经克隆，在不同的种族中的一些常见的突变已经确定。本研究中，对一例以前出生过含有G149E纯合突变小孩的中国人家庭进行产前诊断。 我们采用变性高效液相色谱（ DHPLC）技术检测到了异源双链，即DNA序列变异，该方法对PCR扩增后的分析只需7分钟。在对样本的分析过程中，胎儿DNA扩增的产物的DHPLC分析结果为单峰，表明胎儿DNA为纯合状态。当与野生型的PCR产物混合后分析，则出现双峰，表明胎儿DNA为 G149E 纯合突变，测序分析证实了这种诊断。最后终止了怀孕，对流产胎儿的检测证实了我们的诊断。我们的研究表明 DNA基因突变分析可用于产前诊断，DHPLC是一种功能强大的技术能应用于糖元贮积症和其它遗传病的产前分子诊断。
应用 DHPLC进行遗传性血色素沉着病的基因（HFE）突变筛查
Complete Scanning of the Hereditary Hemochromatosis Gene(HFE) by Use of Denaturing HPLC
Clinical Chemistry 49:9 1633-1640(2001)
背景： 4% 到35%的 遗传性血色素沉着病（ HC）先证者是 C282Y 或 H63D的杂合性突变。或缺乏这二种常见突变。另外，最近报道了15种新的HFE基因突变。我门评估了变性高效液相色谱（DHPLC）筛查HFE基因全编码区序列的可行性，并进一步证实未进行全面HFE基因分型的 HC先证者是否含有不常见的突变。
方法： 通过计算机预测的熔链温度曲线和经验产生的熔链温度曲线确定每个编码外显子的分析条件。为了检测筛查 HFE基因全编码区序列的准确度和优化DHPLC分析条件，每个熔链域都至少用一个作为参考的突变或多态进行验证。我们分析了不100份DNA样本，它们含有C282Y, H63D, 或S65C三种常见的突变，以及14种新发现的突变和3种多态等17种人工产生的阳性对照。
结果： 外显子 1，2，4，5，和6均能通过一个温度进行分析，外显子3显示了复杂的熔链曲线，需要2个温度进行分析。DHPLC检测到了所有的突变和3种多态。
结论： DHPLC技术可以用于 HC先证者中缺乏常见突变的 HFE基因突变的筛查。
用一个新西兰病人队列比较 DHPLC和SSCP技术检测LDLR基因突变
Comparison of SSCP and DHPLC for the detection of LDLR Mutations in a New Zealand Chort
HUMAN MUTATION Mutaton in brief#492(2002)
摘要： 家族性高胆固醇血症（ FH）是一种常见的遗传性疾病，并常伴有动脉早衰的疾病。FH可由低密脂蛋白受体基因 (LDLR)的多种不同的突变 引起，目前已检测到 700种突变，多数突变的发生率很低，并且常常只出现在一个家族。虽然一些特定的突变常常发生在一些特定的族群，但在一些人群具有异质性的国家中（如新西兰），一般都有非常广泛的突变谱，使得基因突变的筛查应成为基因检测的第一步。我们比较DHPLC和SSCP技术检测LDLR基因突变的效率，虽然SSCP在FH病人中检测到了5个LDLR新突变，但DHPLC更敏感，检测到了8个LDLR新突变。其中6个突变 (T392M, R419G,Y421N, 1206-1207delCT, 1872delC, 和 1943delC)集中发生在9和13号外显子的EGF前体同源域，一个突变(679-680delAC)发生在配体结合域（外显子4），第八个突变(P774H)发生在跨膜域（外显子16）。总共在35例病人中检测到了25个突变。我们采用SSCP能检测到64%的突变，而采用DHPLC能检测到100%的突变。所有病人都是杂合突变，并与临床表型一致。
DHPLC进行马凡氏综合征突变分析的评估和应用：在FBN1基因中鉴定了20个新突变和2个新多态
Evaluation and Application of Denaturing HPLC for Mutation Detection in Marfan Syndrome: Identification of 20 Novel Mutations and Two Novel Polymorphisms in the FBN1 Gene
HUMAN MUTATION 19:443-456(2002)
摘要： 原纤蛋白 1（FBN1）的突变引起 马凡氏综合征（ MFS），这是一种常染色体显性的结缔组织异常。FBN1基因突变的信息对病人的早期诊断，临床处理和遗传咨询非常重要。但是，FBN1基因突变检测非常困难，因为此基因非常大（ 约 200kb），大约有350个突变散在分布于65个外显子上。应用常规方法进行大规模的突变筛查费用昂贵，技术要求高和耗时。最近，发展了基于 变性高效液相色谱（ DHPLC）的高效低耗的突变检测方法。为了评估该方法的灵敏度和特异性，我们应用DHPLC技术以盲法筛查了64例已知FBN1基因型的样本，对所有外显子分别以外显子特异的优化条件进行检测。分析了682个PCR扩增产物，从64个已知序列变异中成功检测到了62个变异。在3例未知FBN1基因型的MFS病人中，我们检测到了2 突变和 8个多态。本研究中，共有20个突变和2个多态首次报道。我们的结果显示1）DHPLC是检测FBN1基因突变的高灵敏方法（89-99%， P = 0.05）；2）中度和轻度异常的色谱图也可能是假阳性信号（45-59%，P = 0.05）；3）杂合双链和同源双链的扩增产物的色谱图的差异多数情况下与序列变化的类型无关；4）DHPLC色谱柱的状态，额外的碱基变化，分析的DNA的量都显著影响色谱图的形状。最后对FBN1基因突变筛查的策略进行了讨论。
FBN1基因全面筛查有利于典型马凡氏综合征的鉴别诊断
Comprehensive Molecular Screening of the FBN1 Gene Favors Locus Homogeneity of Classical Marfan Syndrome
HUMAN MUTATION 24:140-146(2004)
摘要： 为了评估原纤蛋白 1基因（FBN1）突变在引起典型马凡氏综合征中的作用，以及含有FBN1基因突变和不含有FBN1基因突变的病人的表型差异，对93例临床上符合根特标准的MFS病人的FBN1基因进行了全面筛查。首先采用 CSGE/SSCP 技术在 73 例病人中检测到了 FBN1基因突变。接着，在突变检测为阴性的病人中，对11例病人进行直接测序检测，对9例病人进行DHPLC检测，分别又检测到7个和5个突变。另外，采用 Southern 杂交又在另一病人中检测到异常杂交信号。在总共 85 个检测到的突变中，有 23 个为第一次发现。比较涉及半胱氨酸的突变和蛋白翻译提前终止突变的病人的表型发现，在眼和 骨骼肌病变方面两者存在显著差异。 8 例未检测到 FBN1基因突变的病人的表型与含突变的病人比较，在心脏， 眼和 骨骼肌病变方面以及阳性家系病史上不存在差异。因此，很可能是由于技术的原因，部分 FBN1基因突变仍未检测到。结论：在至少 91% 的 MFS 病人中 (85/93) 能检测到 FBN1基因突变，强烈提示即便FBN1基因在MFS发病中不是起全部的作用，也是起主要的作用。
评估变性高效液相色谱（ DHPLC）技术分析神经纤维瘤1型（NF1）基因突变
Evaluation of denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) for the mutational analysis of the neurofibromatosis type 1 ( NF1 ) gene
Hum Genet (2001) 109 :487–497
摘要： 检测神经纤维瘤 1型（NF1）基因的突变面临相当大的技术困难，因为该基因非常大，缺乏明显的基因突变热点，病理表型变化大，存在NF1假基因等多种因素。变性高效液相色谱（DHPLC）技术是一种高通量，无危害，自动化程度很高的杂合双链分析技术，因而从多个角度考虑，该技术特别适合NF1这类基因的突变检测。我们对NF1基因的60个外显子及剪接部分的序列的DHPLC快速分析条件进行了优化。并在111例无关NF1病人队列的回顾性研究中对DHPLC检测灵敏度进行了评估，DHPLC检测到了97%的突变。接着在50例无关NF1病人队列的前瞻性研究中，DHPLC在34例病人中检测到了生殖系突变 (68%) ，其中 22个突变是新发现的。这是目前采用单一技术，以基因组DNA为研究对象，对NF1基因检出率最高的方法。
DHPLC 进行苯丙酮尿症突变分析
DHPLC mutation analysis of phenylketonuria
Molecular Genetics and Metabolism 78(2003) 205-210
摘要： 变性高效液相色谱（ DHPLC）是一种灵敏，快速的突变检测方法，已经成功地应用于多种疾病相关基因的突变筛查。 苯丙酮尿症 (PKU, OMIM* 261600;McKusick )是欧洲最常见的常染色体隐性遗传病之一。PAH基因突变主要是点突变。本研究中，我们报道了应用DHPLC技术成功地对125例不相关的 苯丙酮尿症 病例的 PAH基因的全部编码序列进行快速的突变分析。
变性高效液相色谱 (DHPLC)分析意大利Rett病人的 MECP2 基因
DHPLC Analysis of the MECP2 Gene in Italian Rett Patients
HUMAN MUTATION 18:132-140(2001)
摘要： Rett 综合征(RTT)是X连锁的显性神经发育疾病，几乎全部在女孩中发病，发病率占女婴的1/10,000–15,000。甲基化的CpG岛结合蛋白2基因（MECP2）的突变在约75%的经典Rett 综合征女孩中能被检测到，绝大部分突变（99%）是散发性的，因而都属于新突变。我们收集了50例 意大利 经典 Rett女病人的DNA样本，应用变性高效液相色谱（DHPLC）技术分析MECP2基因的所有编码序列，然后进行直接测序。DHPLC技术是近年来发展的方法，通过筛查DNA样本中野生型DNA和突变DNA形成的杂合双链来检测突变，该方法检测灵敏度高，费用低，通量高。我们的分析结果显示，50例病人中的35例 (70%) 中检测到了 19个不同的 MECP2新发 突变，其中 8个以前未被报道过。7个多次发生的突变在22例无关病人中被检测到。DHPLC最初检测到了19种突变中的17种 (90%) ，当 DHPLC的分析条件进行优化后，检出率达到100%，所有反复发生的突变都形成独特的DHPLC峰型。其中有27例病人有详细的临床资料，比较发现发生无义突变的病人比发生错义突变的病人有较轻的表型，虽然这种差异不具有统计学的意义 ( P =0.077) 。
应用变性高效液相色谱技术快速筛查威尔逊氏病携带者
Rapid Identification of Wilson's Disease Carriers by Denaturing High-Performance Liquid Chromatography
Preventive Medicine 35,278-284(2002)
背景： 威尔逊氏病是常染色体隐性遗传病，表现为胆汁中铜排泄减少，血浆铜蓝蛋白中铜掺入降低。致病基因 ATP7B定位于染色体13q14.3，含有21个外显子，编码P型铜转运ATP酶。ATP7B基因突变散在分布于整个基因上，因而临床对突变 携带者的 筛查技术提出了需要。我们探讨了 应用变性高效液相色谱技术筛查威尔逊氏病携带者的应用前景。
方法： 从 5个撒丁人威尔逊氏病家系（32例个体，8例病人）提取基因组DNA，PCR扩增ATP7B基因2-21外显子和5'非翻译区，PCR产物用DHPLC分析和直接测序。
结果： DHPLC检测到3个致病突变和7个序列变异。5例病人为纯合 - 441/ - 427del突变， 3例病人分别为 V1146M和1512-13insT(N505X)，或 - 441/ - 427del和V1146M的复合性杂合突变。18例无病个体为突变 携带者。 序列变异分别为 V290V, A406S, L456V, R832K, A1140V, 以及新发现突变K952R和T991T。DHPLC未检测到新的内含子变异IVS18 - 6c>t。
结论： DHPLC是ATP7B突变筛查的可靠工具，优于传统的单倍体分析技术。 这种技术能对 威尔逊氏病家系 进行 快速，灵敏，和特异的突变检测以及携带者鉴定。 |