DHPLC 在散发型肿瘤基因检测中的应用

高灵敏检测 FLT3基因的内在串联重复和点突变

High-Sensitivity Decttion of FLT3 Internal Tandem Duplications and Point Mutations

摘要： FLT3基因在造血系统祖细胞表面编码表达酪氨酸激酶受体，并在干细胞的生存和分化中起重要作用。目前，在FLT3基因中鉴定了两类与预后不良相关的基因变异。基因近膜部分外显子14和15编码框内的内在串联重复（ITD）引起FLT3激酶持续激活，这种ITD突变存在于大约25%的急性髓性白血病（AML）病人中。FLT3另一种主要的突变是在外显子20的酶激活域中的一个错义突变引起密码子835处天门冬氨酸残基被替换，这种突变存在于不到10%的AML病人中。FLT3的突变检测能提供病人的预后信息，因而可能对病人的有效治疗方案的确定 具有重要意义。 FLT3突变的筛查以及正在进行临床试验的肿瘤特异性药物将为AML病人带来更加有效的个体化治疗手段。我们应用WAVE HS系统发展了一种基于单个的PCR扩增产物的高灵敏的检测技术，可以检测FLT3基因的两类突变。这种检测技术不需要荧光标记引物以及PCR产物的纯化。 这种技术基于 变性高效液相色谱（ DHPLC）分离DNA后，进行荧光染色和检测，并且分别收集突变峰供进一步分析鉴定。本研究显示应用WAVE HS系统能检测到少于1%总样本中的突变FLT3，而如此低的突变水平，采用传统的突变分析手段，如DNA测序和毛细管电泳荧光检测等检测不到突变。这种高灵敏度的检测手段为治疗中和治疗后的监测相关标志的检测带来的很大的利益。

应用 DHPLC荧光检测新技术平台高灵敏地筛查结直肠癌患者癌组织和相应血浆DNA中APC, TP53, K-RAS 和 BRAF基因突变

High-Sensitivity Scanning of Colorectal Tumors and Matched Plasma DNA For Mutations in APC,TP53,K-RAS and BRAF Genes With a Novel DHPLC Fluorescence Detection Platform

 

摘要： 多种方法被应用于从结直肠癌（ CRC）患者的血浆样本中检测肿瘤相关的DNA突变，包括 APC, TP53, 和K-RAS基因。我们报道了应用一种高灵敏的筛查方法筛查APC和TP53基因的突变，这两个基因由于基因型存在高度的异质性，使得筛查手段面临很大的挑战。同时我们还对K-RAS和BRAF基因的特定位点的突变进行检测。在未考虑肿瘤组织的分子靶点的变异和病理特点的情况下， 筛查了 20例 CRC患者的血浆DNA样本APC, TP53, K-RAS 和 BRAF基因突变。我们选择合适的筛查技术和分子靶点， 已知 体细胞中这些 分子靶点的综合突变状态与散发性 CRC相关。我们采用变性高效液相色谱（DHPLC）分离DNA后，进行荧光染色和检测的新技术筛查突变。这种新技术能检测到少于0.1%总样本中的变异DNA。随后用突变等位基因特异的扩增（MASA）技术鉴定K-RAS密码子12，13，61位点和BRAF密码子599位点的突变。应用这种联合的筛查和检测技术，我们能在所有20(100%)例 CRC样本中检测到至少一个突变。没有一例样本在肿瘤组织中未检测到突变而血浆中检测到了突变。因而，应用这四个遗传标志能在所有的CRC患者中检测到突变(100%)，每个患者至少含有一个突变。在5/20例 (25%)患者中检测到了单个突变，14/20例 (70%)二个突变，1/20例 (5%)三个突变。最常见的单突变是K-RAS，为3/20 (15%)，而最常见的双突变是APC和p53，为7/20 (35%)。p53与K-RAS或BRAF的双突变少见，均为(1/20)，而K-RAS和BRAF突变未同时出现。本研究结果表明肿瘤突变即便是在一个很小的样本队列中也显示高度的异质性，本文介绍的技术为CRC患者的遗传筛查提供了一种具有吸引力的途径。这种全面筛查技术对CRC的筛查，治疗中和治疗后的监测具有重要意义。目前正在进行更大规模的相同研究以便确定这种基因靶点组合筛查对不同期CRC病人的特异性。