基因剂量变异分析

基因拷贝数异常可以从整条染色体拷贝数的变化到基因单个外显子缺失或重复，这类遗传变异也是导致遗传性疾病和肿瘤的重要致病因素。如染色体 13，18，21，X，Y数目异常，杜氏肌营养不良和 视网膜母细胞瘤 等疾病都涉及大片段的缺失或重复。基因拷贝数异常的检测需要专门的技术，这种异常容易被正常等位基因所掩盖，或是被显性或隐性疾病中等位基因的其它种类的变异所掩盖而不能被检测。

将 DHPLC技术和多重PCR技术相结合，可以精确、 可靠检测基因的拷贝数 。首先用未标记的引物在半定量条件下同时扩增多个外显子或染色体特异的序列，然后 PCR产物用DPHPLC技术在非变性条件下分离，最后用紫外检测或后荧光检测技术进行荧光检测定量，系统 基于峰高和峰面积进行定量 。荧光染料的高灵敏性使得可以将 PCR扩增反应停止在指数增长期，从而使每个扩增产物的峰的相对强度直接反映了各外显子的拷贝数。

DHPLC检测基因拷贝数是一种简单，快速，非凝胶的方法，该技术灵敏度和特异性非常高可以 高通量的鉴别单拷贝，双拷贝，三拷贝。另一个优势是引物费用低廉，无需标记。为了提高检测灵敏度，还可以配备有荧光检测装置。由于方法的简单和良好的性价比，许多客户定制的有关 DNA拷贝数的研究和许多需要一系列不同引物的分析都可用DHPLC技术进行。

参考文献

1. Chia-Cheng Hung, Yi-Ning Su,Chia-Yun Lin, et al. Denaturing HPLC Coupled with Multiplex PCR for Rapid Detection of Large Deletions in Duchenne Muscular Dystrophy Carriers, Clinical Chemistry. 2005;51:1252-1256

2. C.Dehainault 1 , A.Lauge′ 1 , V. Caux-Moncoutier 1 , S.et al. Multiplex PCR/liquid chromatography assay for detection of gene rearrangements: application to RB1 gene . Nucleic Acids Research, 2004, 32(18 e139)

应用举例：

变性高效液相色谱结合多重 PCR技术快速检测杜兴肌营养不良携带者大片段缺失

Denaturing HPLC Coupled with Multiplex PCR for Rapid Detection of Large Deletions in Duchenne Muscular Dystrophy Carriers,

Clinical Chemistry 51, No. 7 ， 1252-1256, 2005

杜兴肌营养不良（ DMD）和贝克肌营养不良（BMD）在新生男婴中的发病率为1/3500。DMA和BMD都是X染色体连锁的隐性遗传病，源于 Xp21.1处的dystropin基因突变。其中约2/3的病例由女性携带者遗传，其余的病例由个体新发生的突变引起，无 肌营养不良的家族史。

约 60%的DMD病例的发病与基因内一个或多个外显子的大片段缺失相关，涉及基因近端和中间两个热点区域（外显子3-7和外显子44-55）。约6%的DMD病例的基因变异与基因内大片段重复相关。剩下的病例源于基因的点突变，小片段的缺失和插入。

正如 Chamberlain 和 Beggs 等介绍的方法，受累的男性病例很容易通过多重PCR反应中特定扩增产物的缺乏进行诊断，不同频率的缺失的检出率高达98%。但是对于携带者，由于未发生缺失的一条X染色体的妨碍，使得诊断DMD携带者较困难。现在已经报道了多种进行DMD携带者诊断的策略，如定量Southern杂交，荧光原位杂交，连锁分析，基于荧光分析的技术，微芯片电泳，毛细管电泳，多重扩增的探针杂交，多重连接依赖的探针扩增等。

变性高效液相色谱技术（ DHPLC）是一种简单，快速，非凝胶，非荧光依赖的方法，应用离子对反相液相色谱原理进行DNA变异检测，该技术灵敏度和特异性非常高。我们将DHPLC技术和多重PCR技术相结合，介绍了它在有效和精确诊断DMD家系中DMD携带者和非携带者的新应用。

多重 PCR/高效液相色谱技术检测RB1基因重组

Multiplex PCR/liquid chromatography assay for detection of gene rearrangements: application to RB1 gene

Nucleic Acids Research, 2004, Vol.32,No.18, 139

MP/LC技术被证实是一种简单，通用，高性价比的技术，特别是对DHPLC用户，可以扩展DHPLC检测范围摘要： 大片段基因重组的筛查技术作为分子医学的重要组成部分已经建立，但仍然面临挑战。许多种可靠的技术能检测整个基因的缺失，但对于一些较小的缺失，如单外显子的缺失无能为力。这篇文章介绍了一种新的，通用的可靠技术来检测外显子的拷贝数，即 多重 PCR/高效液相色谱技术（MP/LC）。用未标记的引物同时扩增多个外显子，然后用离子对/反相高效液相色谱（IP-RPHPLC）分离，最后用后荧光检测技术进行荧光检测定量。每个目标片段峰的相对荧光强度直接反应了外显子的拷贝数。采用这种新技术对121个不相关的视网膜母细胞瘤病人进行了筛查，并对他们采用过去已建立的参控技术进行了检测。 MP/LC正确检测出了所有缺失，并且还检查出了一个以前未被检查出的RB1重复。。