技术支持

Transgenomic公司为用户提供的技术支持包括：

1、WAVE核苷酸片段分析系统硬件的售前技术咨询及仪器的售后维修服务
2、DHPLC方法的应用技术咨询：DHPLC条件优化，PCR条件优化，引物设计等 与DHPLC分析检测相关的每个实验过程。
3、定期的培训讲座。
4、邀请国外相关学科学者到中国进行学术报告。
5、液相色谱柱产品售前售后及应用技术支持。

美国Transgenomic有限公司在中国的北京、上海、广州均设有办事处，在中国建立了完善的销售及强大的技术服务体系。同时，Transgenomic公司中国代表处不仅在中国销售WAVE核苷酸片段分析系统仪器和RNA/DNA合成试剂及提供技术服务，还广泛地开展与国内实验室之间的合作并积极促进国内实验室和国外实验室之间的技术交流，Transgenomic公司中国代表处完善强大的技术支持体系确保了接到用户需求后24小时内到达现场提供服务，同时还有各个学科的资深专家提供技术咨询，包括肿瘤流行病学（癌症基因突变）、遗传病基因诊断、老年病（Parkinson)、wilson、β-地中海贫血及法医鉴定等领域，相关的培训信息请您关注我公司中国网站的公司公告栏目。

DHPLC 分析的样本准备

1、样品制备和预处理

DHPLC 突变检测原理是依据 DNA 同源双链和杂合双链从色谱柱上的洗脱时间不一进行分离。纯合突变产物与野生型 PCR 产物的 DHPLC 色谱图峰型相似，不能被识别鉴定。只有杂合双链 DNA 分子（即 DNA 分子一条单链含突变碱基，另一条单链为野生型），才能被灵敏地检出。

DHPLC 分析样品一般是未经纯化的 PCR 扩增产物。杂合突变样品可直接用于分析，纯合突变的样品与野生型样品等比例混合， 经过 95 ℃变性5min ，然后，每分钟降 1 ℃，直至 45 ℃， 可直接通过 DHPLC 在部分变性温度下进行检测。

2 、DHPLC 检测所需要的 PCR 产物最低进样量

DHPLC 是一种灵敏的突变检测技术，对 PCR 扩增的严谨性、特异性要求较高。 PCR 产量不足，且特异性差时， DHPLC 的色谱图常不易判断； PCR 过度扩增时，一方面增加碱基错误掺入的可能性，导致假阳性；另一方面，非特异性扩增产物含量增加，往往导致 DHPLC 分辨能力的下降，或形成异常峰型，容易导致检测失败。

PCR 产物总量约为 60ng 时，同源双链 DNA分子足以被 DHPLC 检出，形成较小的同源双链峰；异源双链 DNA 分子虽然可被识别，但峰型不明显，难以被准确地辨别。 PCR 产物总量 >120 ng 时，异源双链峰已十分明显。 因此， DHPLC 紫外检测系统对含突变成分的 PCR 产物总量的最低要求大约为 70 ～ 80ng （ DHPLC 仪器的峰吸收值大于 2mV ） 。

3、 PCR 产物的大小

适合 DHPLC 分析的 DNA 分子的大小为 150-800bp ，最合适的片段大小为 300bp 左右。 为了保证筛查的灵敏度，我们建议您的扩增产物最好为 300bp 左右。

4、PCR 引物设计

PCR 引物设计遵循一般引物设计原则。在条件许可下： 1 尽量使扩增产物的 GC 分布比较均匀； 2 尽量使 GC 含量高的区域在扩增片段的两端； 3 在检测高 GC 含量区域的突变时，有时可能需要在引物的 5 '端加 GC 夹。在设计引物时，最好使您感兴趣的区域距扩增片段两端约 30-50bp 以上。

5、阳性结果的判断

由于不含突变位点的 PCR 产物（野生型 PCR 产物）只有单一成分（即同源双链 DNA 分子）， DHPLC 图谱上呈现为单一峰型（同源双链峰， Homoduplex peak ） 。含突变成分的 PCR 产物，经变性、退火处理后形成了异源双链和同源双链两种 DNA 分子。异源双链 DNA 分子由于含不匹配的碱基位点，在 DHPLC 检测温度下容易解链成单链 DNA 分子，与 DNASep ®检测柱 的结合能力较双链 DNA 分子低，优先被洗脱液洗脱下来，形成异源双链峰（ Heteroduplex peak ）。因此，与野生型 DNA 片段色谱峰相比，含突变位点的 PCR 片段 DHPLC 图谱上多 1 ～ 2个色谱峰，有的样本则表现为肩型峰等。

6、 DHPLC 可检出的 PCR 产物中突变成分最少百分含量

在含突变成分的 PCR 产物中， DHPLC 能检出的突变产物的最低量（百分含量）是评价 DHPLC 灵敏性的一项重要指标。 DHPLC 能灵敏地识别 PCR 混合物中突变成分的最低含量为 5% 左右。当 PCR 混合物中突变 DNA 分子达到 10% 以上时，异源双链都能被有效地检出。

7、 PCR 条件

DHPLC 是最近几年才发展起来的一项基因突变检测技术，由于它具有灵敏、特异、快速、高通量、低成本等优点， 这种高灵敏性往往受到许多因素的干扰。比如，检测温度、 PCR 引物设计、 PCR 条件控制。

DNA 聚合酶是 DHPLC 突变检测的一个重要影响因素。 DNA 聚合酶对 DHPLC 分辨力的影响主要体现在：产生假阳性或假阴性结果；形成不可分辨的异常 DHPLC 峰型，导致检测的失败。 大多数 Taq DNA 聚合酶扩增产物， DHPLC 主峰前（此处为同源双链峰）常见到一个额外的小峰，但一般不影响分析。 为了提高 PCR 扩增的保真性， Pfu DNA 聚合酶通常是优先选用的品种。对于小于 250bp 的片段，当 PCR 循环数与碱基数的乘积 < 10000 时， Taq 或 Taq Gold 聚合酶也能获得保真性较高的 PCR 产物。

目前国内用户为降低成本，常选择普通的 Taq 酶，有些公司的酶效果较好，有些则很差，因而，在大规模实验之前，应进行预实验 。

PCR 反应液中应避免的成分 ：

PCR 反应液中应控制浓度的成分 ：

注：检测含有上述成分的样品时，只能采用“ Active clean ”模式清洗柱子。

WAVE核苷酸片分析系统的售后服务Package：

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