DHPLC技术在肿瘤基因检测中的应用
1 肿瘤放疗相关基因检测应用
目 前，放疗仍是癌症治疗的三大手段之一，放疗治疗肿瘤的原理是利用放射线对癌细胞进行杀灭，但由于肿瘤细胞生长在正常组织中，其形状很不规则，因此放疗时就会伤及正常组织，增加了放疗的副反应。而且，由于副反应的增加，就不能进一步增加放疗剂量，又达不到根治肿瘤的疗效。
不同个体间放疗副作用的差异很大，同样的剂量和治疗方案，有些个体基本无毒副作用，而对另外一些个体，则可能产生非常严重的毒副作用。研究表明个体间的这种放疗反应差异，只有 10-20% 是由于射线的随机效应一起，而 80 — 90% 是由个体的基因差异决定的。因此，在放疗前，如果能对病人进行相关基因的检测，就能预测病人可能发生的毒副作用，从而制定更加有效的治疗方案。
其中 ATM 基因在引起个体放射敏感性中起重要作用，也是目前在临床放疗中最受关注的一个基因。 ATM 基因突变个体在常规的放疗中，就容易一起严重的毒副作用。最近， A NDREASSEN 等人 应用 DHPLC 技术快速，灵敏，简单的特点，对术后进行放疗的乳腺癌病人的 ATM 基因的所有 62 个外显子进行突变筛查，发现 ATM 基因 5557 G/A 多态 与射线引起的三级皮下组织纤维化显著相关， ATM 基因 5557 G/A 和 5557 A/A 与正常的 5557 G/G 比，在较低的剂量就引起三级皮下组织纤维化。 C ESARETTI 等人 应用 DHPLC 技术对进行放疗的前列腺癌病人的 ATM 基因进行突变筛查，发现 ATM 基因发生变异的病人中， 63% 的病人出现至少一种副作用，而 ATM 基因正常的病人中，副作用的发生率只有 14% 。而如果只以错义突变为指标，则突变病人副作用发生率是 78% ，无此突变的病人的副作用发生率为 21% 。这一结果表明检测 ATM 基因突变可以预测 前列腺癌病人放疗的副作用。
除了 ATM 基因，其它几个基因如： TGF β 1 , XRCC1 , XRCC3 , SOD2 , 和 hHR21 也与肿瘤放疗副作用发生密切相关。采用 DHPLC 技术检测这些基因突变的方法都有报道，因此，应用 DHPLC 技术平台，开展肿瘤放疗病人这些基因的检测，有可能大大降低病人的不良反应。
肿瘤的常规分割放疗是标准方法，一直沿用至今。常规分割放疗有时不一定就是最佳分割方法，根据临床需要还有以下几种分割方法：分段治疗、超分割治疗 、加速超分割治疗。后两种方法的全疗程所用时间缩短，疗效有所提高。但急性副反应常较重、较多，有的还发生严重的远期不良反应。虽然大多数病人可接受这些副作用，但部分病人采用超分割治疗不能带来更大的利益。 Eriksen 等人在研究喉癌病人的放疗中，选择几个分子靶标，建立了 超分割治疗的适应症的分子指标，其中包括应用 DHPLC 技术分析 P53 基因突变。
2 肿瘤化疗相关基因检测应用
许多基因与肿瘤化疗药物疗效和毒副作用大小密切相关，如 代谢酶基因、 DNA 修复基因、细胞生长及凋亡相关基因、耐药基因等。 不同个体对同一种药物具有不同的反应，就是因为这些基因突变或以不同的多态等位基因的形式出现的结果。 X
编码药物代谢酶类的基因发生突变可能影响受药个体对特定药物的反应，进而影响该个体使用该药物的有效性和安全性。比如细胞色素基因家族中的许多基因编码的代谢酶在许多肿瘤化疗药物的代谢中起重要的作用，基因的不同等位基因多态表达的酶活性的差异，导致个体间药物的有效浓度和毒性差异很大。遗传药理学的实验数据可在药物研发和临床用药过程中起到辅助作用。此外，药物靶点本身以及疾病相关基因的遗传变异也可对药物的治疗结果产生影响。这些遗传变异可以成为有力的药效指标，也可以成为临床诊断和预后的标志物。当深入了解了各种疾病的遗传变异机理后，人们就可制定相应的治疗策略对这些疾病进行正确的诊断和治疗了。
比如 RCC1是重要的DNA修复基因，它编码的蛋白质与DNA 连接酶Ⅲ相互作用，修复DNA 单链断裂，并与DNA聚合酶β一起进行碱基切除修复。由于存在SNP，不同个体的XRCC1活性不一样，这可能是导致个体间修复能力差异的分子基础，从而影响铂类药物化疗的疗效。
二氢嘧啶脱氢酶 (DPD) 突变影响 5-FU 的代谢 ， 野生型 DPD 基因在 14 外显子含 GT 序列，这是将 5-FU 代谢成二氢 -5-FU 所必需的 。 14 外显子剪接位点一个 G- 到 -A 的转换导致转录时整个外显子缺失 ， 合成无功能的蛋白 ， 肝 DPD 活性低档的病人不能代谢 5-FU( 治疗结肠癌和乳险癌 ) 引起聚集和毒性 。 胸苷激酶 (TS) 多态也影响 5-FU 的功效，在肿瘤组织中， 5-FU和5-FdUMP 的活化代谢抑制 TS。TS 基因增强子区域带有 3 个 28bp 串联重复比含 2 个串联重复具有更高的 TS 活性，对 5-FU 更低的反应性。 以 5-FU治疗结直肠癌 的标准治疗方法 为例， 有效率约 为 30%，而 约 20% 的病人经标准的 5-FU 治疗后产生严重副反应。
对肿瘤患者开展这些化疗相关基因的检测，可以指导临床针对病人具体情况选择合适的化疗药物，提高治疗效果，降低毒副作用 ，作为药物治疗的预测性指标 。目前，应用 DHPLC技术开展的化疗相关基因突变检测研究的报道非常多，比如 细胞色素基因家族中重要药物代谢酶基因的基因分型， 有些已经开始应用于临床。
3 遗传性肿瘤早期诊断
现在已经公认肿瘤是一种多因素引起的遗传性疾病，许多肿瘤易感基因已经被发现，它们在引起遗传性家族性肿瘤中的机理已经被阐明。这些基因在家族中的胚系突变将大大提高家族成员的患癌风险，因而对高风险家族中肿瘤易感基因突变的检测，能在患癌之前评估患癌风险，进行肿瘤早期诊断，指导临床合理治疗。
乳腺癌分散发性乳腺癌家族性乳腺癌，约 5%～10%的乳腺癌来自家族遗传。家族性乳腺癌与乳腺癌易感基因胚系突变高度相关，其中BRCA1和BRCA2是最常见的乳腺癌易感基因。家族性乳腺癌具有高遗传倾向，在一般家族里，约有0.5%的人带有BRCA1或BRCA2基因之突变，而在具有家族性或早发性乳腺癌之家族中，BRCA1或BRCA2基因之突变发生率，高达50%，因而BRCA1和BRCA2的突变与家族性乳腺癌发生有密切关系。一旦此基因产生突变，其家族子代中所有成员皆有50%的机会带有此突变基因。对于来自家族性遗传性癌的高风险人群进行基因突变检测是降低患癌风险的首要环节。 BRCA 基因突变检测服务，可以评估家族性乳腺癌的发生风险，以尽早采取预防和治疗措施，是为减少家族成员患癌及提高生存率的有效途径。 BRCA1和BRCA2基因突变是常染色体显性遗传，有50%的可能遗传给子女，对先症者的基因诊断有助于指导对其后代进行产前诊断，降低后代的乳腺癌发病风险。
变性高效液相色谱 (DHPLC)作为一种高效和敏感的检测技术，已经成为一种标准的突变预筛查工具。 DHPLC 检测以其自动、快速、高通量、准确、稳定、重复性好、检测精度高、低消耗、操作简单（样品准备容易）等优势，在众多筛查方法中脱颖而出，成为目前理想的乳腺癌筛查方法，突变检测的首选技术。 DHPLC 技术已广泛应用于肿瘤和遗传病等多种基因突变的研究，许多研究成果已经开始应用于临床诊断服务。在欧美等国家，应用 DHPLC 技术进行 BRCA1和BRCA2基因突变检测的临床服务已经在许多著名的遗传检测服务机构广泛开展，并且他们通过协作制定了一整套应用该技术进行BRCA1和BRCA2基因突变检测的标准操作程序，最大程度地保证了DHPLC技术检测BRCA1和BRCA2基因突变的可靠性。目前DHPLC技术检测BRCA1和BRCA2基因突变已经成为家族性乳腺癌遗传检测的标准方法。
遗传性非息肉性结直肠癌（ HNPCC）是另一个 家族性肿瘤的例子，其中 90%为 遗传性非息肉性结直肠癌 , 只有10-15% 散发。 遗传性非息肉性结直肠癌患者中一组 DNA损伤修复基因出现突变，其中MLH1 和 MSH2基因是最主要的两个修复基因， 与 遗传性非息肉性结直肠癌的 发生有密切关系。 应用 DHPLC 技术进行 MLH1 和 MSH2基因 突变检测的技术已经很成熟，国外已经在许多著名的临床服务机构广泛开展临床检测。
4 肿瘤基因标志物的筛选
分子生物学和人类基因组学的发展使人们对癌变、侵袭转移的分子机理，以及一些生物信号传导通路的认识得到进一步加深，并为癌症的早期诊断和开发新的治疗方法提供了机会。 目前肿瘤的药物治疗正处于从单纯细胞毒性攻击到分子靶向性调节的过度时期，即 癌症靶向治疗， 为达到这一目的，我们需要更多地了解靶向药物及其治疗的相关知识。
分子靶向肿瘤治疗 是 一把双刃剑 ， 高度的靶选择性同时也容易出现耐药。 一些 新近研发的靶向治疗药物也不断出现耐药的文献报道， 而 相关基因常见的突变常常不能囊括所有耐药的原因，因而 靶向治疗的一个关键问题就是找到最佳的治疗对象 , 不同个体的肿瘤的 “ 遗传特征 ” 可能成为选择最佳治疗策略的重要指标， 对于同一种药治疗同一种病，不同个体的疗效有所不同。比如， 表皮生长因子受体 (EGFR)抑制剂是肺癌领域研究热点之一,其治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的客观有效率为10%-27% EGFR突变与吉非替尼治疗客观有效率相关性最强。 如 EGFR有突变的NSCLC，无论是吉非替尼还是埃罗替尼（erlotinib，Tarceva）都有较好的疗效。 EGFR基因突变与gefitinib疗效相关的发现掀起了一个寻找疗效预测指标的研究高潮， 体外检测鉴定突变作为预测性指标，对于肿瘤的靶向治疗具有重要的指导意义。
DHPLC 技术广泛应用于肿瘤靶向治疗中靶基因的突变分析，如最近报道应用 DHPLC 技术研究 NSCLC病人中EGFP基因突变的结果表明该技术比测序技术优越，具有100%的灵敏性，和重要的临床 预测价值。
5 肿瘤发生发展中体细胞低突变基因的检测
大多数癌症患者是在其生命过程中，通过体细胞遗传改变引起的，检测这些体细胞遗传变异对癌症患者的治疗非常重要，它有助于癌症的早期诊断，治疗方案的确定，治疗反应评价和疗效监测等，以及帮助临床医生对基于靶向药物的个体化治疗方案的选择和决定。
但是，散发性癌症基因变异的分子谱分析面临很大的挑战： 1 ）散发性癌症都是进展性的，在癌症发展的早期，只有极少数的突变细胞混合存在于大量的正常细胞背景中； 2 ）癌症的发生涉及多种信号通路和基因参与； 3 ）由于肿瘤发生部位的限制，有些实体性肿瘤组织样本的获取存在困难。因此，目前迫切需要一种高度灵敏的检测手段来检测血浆或实体肿瘤组织等高度异质性样本中低水平的突变细胞。这种检测手段除了需要满足高灵敏度的要求外，还必需满足能高性价比地对多个基因进行检测。
变性高效液相色谱 (DHPLC) 技术由于其高准确度，高通量和低成本的特性，已广泛应用于遗传性疾病的临床遗传诊断。一种新的进行癌症基因分子谱分析的高灵敏的 DHPLC 荧光检测技术平台已成为 开展散发性遗传性癌症的低水平体细胞突变检测的临床应用的唯一技术 。应用该技术对非小细胞肺癌和结直肠癌中一系列与病理表型相关的体细胞突变， 即分别对来自原发肿瘤组织和相应病人血浆抽提的 DNA 进行了不同基因组合的检测，其中进行突 变检测的基因包括： PTEN, TP53, p16, KRAS, NRAS, BRAF, MET, 和 EGFR等。比如，目前已经 建立了 DHPLC技术高灵敏筛查和检测 结直肠癌 病人肿瘤组织和血浆样本中基因突变的方法 ， DHPLC 筛查 APC 和 p53 突变的检测低限为 1:200 到 1:2000。 结直肠癌中少于 0.5% 的 APC 等位基因的突变和 p53 等位基因外显子 2 到 11 的缺失突变能可重复的检测到。
6 肿瘤错配修复基因甲基化检测
甲基化与肿瘤的发生有非常密切的关系。在一般正常的细胞中，基因调控区 CpG 岛处于非甲基化的状态。而当细胞发生癌变后，这些 CG 区域往往呈现甲基化状态。 DNA 甲基化的改变是肿瘤发生的早期信号，可以用于肿瘤的分类诊断。 目前 DNA 甲基化研究是肿瘤分子生物学研究的一个重要领域。 快速，高通量，高灵敏的技术仍然是 甲基化检测的技术难题。变性高效液相色谱技术结合亚硫酸氢钠转化后的无偏 PCR 扩增是甲基化检测的一种很好的选择，这种技术特别适用于具有不同甲基化程度的样本的大规模筛查。
DHPLC 技术检测 DNA 甲基化类似基因突变的检测。该技术也是基于亚硫酸氢钠处理 DNA 后，设计不含甲基化位点的引物，同时 PCR 扩增所有甲基化和非甲基化的目的片段，直接进行 DHPLC 分析。亚硫酸氢钠处理 DNA ，使未甲基化的胞嘧啶（ C ）脱氨基变成尿嘧啶（ U ），经扩增后变成胸腺嘧啶（ T ），而甲基化的 C 保持不变。这样一来， 甲基化和非甲基化的 DNA 序列在甲基化的位点就出现了碱基差异，甲基化的 DNA 序列比非甲基化的 DNA 序列含有更高的 GC 含量。当甲基化的 DNA 序列和非甲基化的 DNA 序列序列混合后变性，退火，将形成杂合链，在 DHPLC 柱上优先洗脱下来，即便是少至一个位点的甲基化，也可以检测目标片段上的甲基化。
当该序列上 甲基化位点较多时， PCR扩增后，将使甲基化和未甲基化序列之间产生多个杂合位点，抑制它们之间的退火，进行DHPLC分析时，往往只有甲基化和未甲基化序列两个同源双链峰，而没有杂合双链峰，或是杂合双链峰较小，非甲基化的DNA序列比甲基化的DNA序列优先洗脱下来。因而比较两个甲基化和未甲基化序列同源双链峰的高度或面积就能相对定量甲基化的程度。这种方法能检测目标片段任意CpG位点的甲基化状态，非常适合高通量的分析。并且无论是一个，还是多个甲基化位点，都能应用DHPLC进行快速分析。
应用 DHPLC技术分析甲基化具有多方面的优点。首先它检测的甲基化位点不受限制，可以检测单个或多个位点的甲基化，提供整个目标片段的甲基化总体水平；其次，由于甲基化与非甲基化的PCR产物的色谱峰是分离的，分别测量它们的峰高或峰面积可以进行相对定量的分析；最后，DHPLC技术分析不需要其它的操作，特别适合大规模筛查，他的结果判断非常直观；
目前已经建立了应用 DHPLC 技术进行肿瘤抑制基因起动子异常甲基化预先筛查的方法。特别是对 p16 基因的异常甲基化 进行了大量的分析，结果表明 DHPLC 技术分析 甲基化是一种可靠和高敏感，高通量的技术。应用该技术 进行甲基化状态分析的基因包括： APC, MLH1, p16, p14, MGMT, GSTP1, DAPK, RASSF1A, RUNX3, RARB2, 和 FHIT 等 。 |