DMD专题 一. DMD基因大片段缺失检测 杜兴肌营养不良（ DMD）和贝克肌营养不良（BMD）在新生男婴中的发病率为1/3500。DMA和BMD都是X染色体连锁的隐性遗传病，源于 Xp21.1 处的 dystropin 基因突变。其中约 2/3 的病例由女性携带者遗传，其余的病例由个体新发生的突变引起，无 肌营养不良的家族史。 约 60%的DMD病例的发病与基因内一个或多个外显子的大片段缺失相关，涉及基因近端和中间两个热点区域（外显子3-7和外显子44-55）。约6%的DMD病例的基因变异与基因内大片段重复相关。剩下的病例源于基因的点突变，小片段的缺失和插入。 正如 Chamberlain 和 Beggs 等介绍的方法，受累的男性病例很容易通过多重PCR反应中特定扩增产物的缺乏进行诊断，不同频率的缺失的检出率高达98%。但是对于携带者，由于未发生缺失的一条X染色体的妨碍，使得诊断DMD携带者较困难。现在已经报道了多种进行DMD携带者诊断的策略，如定量Southern杂交，荧光原位杂交，连锁分析，基于荧光分析的技术，微芯片电泳，毛细管电泳，多重扩增的探针杂交，多重连接依赖的探针扩增等。 变性高效液相色谱技术（ DHPLC）是一种简单，快速，非凝胶，非荧光依赖的方法，应用离子对反相液相色谱原理进行DNA变异检测，该技术灵敏度和特异性非常高。我们将DHPLC技术和多重PCR技术相结合，介绍了它在有效和精确诊断DMD家系中DMD携带者和非携带者的新应用。 我们分析了 84例来自国立台湾大学医院的DNA样本，包括11例经凝胶电泳检测含有 dystropin基因缺失的样本，1例经多重PCR/DHPLC检测，后经实时定量PCR确认含有重复的样本，23例来自DMD病人家系的可能携带者和非携带者样本，50例来自一般人群的未发病的女性样本。基因组DNA 用Puregene DNA 纯化试剂盒 (Gentra Systems)按照试剂盒配套方法从外周全血中提取。 按照 Chamberlain 和 Beggs 等介绍的方法扩增dystropin基因。多重PCR反应液I（外显子3，50，6和60）和多重PCR反应液II（肌肉启动子（pm），外显子43，13，47和52）按照Beggs等介绍的方法。多重PCR反应液III（外显子48，17，8，44和46）和多重PCR反应液IV（外显子45，19，51，12和4）按照Chamberlain等介绍的方法。 每组多重 PCR反应液的体积为50μl，包括200ng 基因组DNA，0.04–0.4μM 引物，200μM dNTPs，1U 的AmpliTaq Gold 酶 (PE Applied Biosystems)，5μl 的 GeneAmp 10X缓冲液II [10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl，2mM MgCl 2 ]。由于不同引物的扩增效率不一样，调节多重PCR反应液中不同引物的浓度，使同一多重PCR反应体系中的所有扩增片段的效率大致相当。PCR反应在MBS热循环仪上进行(ThermoHybaid)，起始变性条件为95 °C 变性10 min，接着进行24个循环：94 °C 变性 1 min，59 °C 退火 1 min， 72 °C 延伸 3 min， 最后在72 °C 延伸 10 min。 我们按照以前介绍的方法，加 40μl的PCR产物到DNASep色谱柱上(Transgenomic)，应用WAVE DHPLC仪器(Transgenomic)进行多重产物的检测。缓冲液B的起始和终末浓度分别是46% 和 70%。流速为0.9 mL/min，分析温度为50 °C。 对每个样本，我们用 WAVE MAKER软件自动测量每个外显子产物峰的高度和面积。按照检测大片段基因缺失和重复的基因剂量分析方法，通过下面的公式计算未知样本中特定外显子的拷贝，从而确定是否为女性携带者 拷贝数 =[待测外显子的高度（面积）（U）/参考外显子的高度（面积）（U）]/ [待测外显子的高度（面积）（C）/参考外显子的高度（面积）（C）] 其中 U代表未知样品，C代表对照样本。与发生缺失和重复的待测外显子一样，参考外显子是同一多重PCR反应体系中未发生缺失和重复的外显子。 我们确定了 PCR扩增产物线性增长的影响因素，检测了循环数（22-28循环），DNA模板浓度(50–400 ng)和PCR扩增产物的量的关系。最后将定量PCR反应的条件标准化为进行24个循环，DNA模板浓度为200ng。 利用这一技术对常见的 dystropin基因的外显子缺失进行了检测。我们根据各外显子的大小和扩增效率将19个外显子分配到4组多重PCR反应液体系中。对PCR扩增产物同时进行凝胶电泳和DHPLC分析(图1 该文的在线版本的数据附件在http://www.clinchem.org/content/vol51/issue7/)。如果特定的信号出现在对照样本中而不出现在病例样本中，表示该对应的外显子在病例中缺失。 应用多重 PCR/DHPLC技术对来自不同DMD家系的男性病人，携带者，和非携带者检测的结果见图1。所有结果都通过缺失外显子与未缺失外显子的比例进行分析。每个样本至少分析3次，结果的重复性很好。如果在某个外显子缺失的个体中相应信号消失，那末该特定外显子的扩增信号降低的个体就可以检测出来。在家系C中，母亲无明显的基因剂量变化，因而推断基因变异是新发生的。在家系D中，同一多重PCR反应体系中不只一个外显子发生缺失。在这种情况下，携带者还是可以通过计算待测外显子与参考外显子的比例进行检测。 应用多重 PCR/DHPLC技术计算待测外显子与参考外显子的比例，测量来自携带者，非携带者和无病女性的dystropin基因的拷贝数的结果见在线数据中的图2。利用这种分析技术可以对缺失和未缺失的外显子进行准确无误的区别，从而成功诊断出正常的女性（在线数据中的表1）。在我们的研究中，通过将每个外显子的扩增产物的峰高和面积除以参考外显子的峰高和面积，以及将未知样本与对照样本进行比较，来确定每个外显子的拷贝数。理论上，单拷贝外显子的值应为1，双拷贝外显子的值应为2。所有单拷贝外显子和双拷贝外显子的测量平均值见在线数据中的表1。所有对照样本中的值没有任何交叉。应用多重PCR/DHPLC技术将所有DMD携带者的大片段缺失都准确无误的检测出来了。而且一例发生了基因重复的病人也得到了准确无误的检测（图1）。最近，报道了应用类似的技术检测RB1基因的重组。 不象其它技术，如毛细管凝胶电泳，多重扩增的探针杂交和多重连接依赖的探针扩增等，多重 PCR/DHPLC技术应用自动化的仪器进行紫外线检测，不需要同位素或荧光素标记，不需要凝胶 材料，因而加快了携带者的检测速度 。对于临床应用，该检测系统的一个特别的优点在于对携带着的检测数据的解释非常直观。另一个优点是 PCR产物在DHPLC分析前不需要进一步的纯化。应用我们的方法进行4组多重PCR反应的检测，约需要3小时进行PCR，约48分钟进行DHPLC分析。每一个样本的DHPLC分析成本不到4美元。因而该技术特别适合日常临床诊断。 总之，多重 PCR/DHPLC检测系统是一种简单，快速，功能强大的技术，能直接检测DMD病人和携带者的基因缺失和重复。这一系统也适合其他涉及基因缺失和重复的遗传病的诊断。
图 1 四个家系样本的4组多重PCR反应的DHPLC色谱图。家系A，受累男性和携带者（母亲）缺失外显子 48–52。 家系 B，受累男性和携带者（母亲）缺失外显子 51。 家系 C，受累男性缺失外显子 50–52，其母亲为非 携带者。家系 D，受累男性和携带者（母亲）缺失外显子 45–60。 家系 E，受累男性重复外显子 12–19。 二. DMD基因点突变检测 Protocol PCR reaction - Abgene Thermo Start AB-0908/b
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