DHPLC 突变检测技术的准确性

迄今为止，用于筛查疾病相关基因突变的方法有很多种。它们包括：单链构象多态性（ SSCP ），构象敏感性凝胶电泳（ CSGE ），变性梯度凝胶电泳（ DGGE ），双相基因扫描（ TDGS ），直接 DNA 测序，基因芯片分析技术等。在过去几年中陆续有报道指出， DHPLC 突变检测技术与其它方法相比，具有更高的准确性和敏感性 。

最近有一项盲性研究，通过对 BRCA1 基因进行突变筛查，将 DHPLC 和其它方法的准确性进行了比较 。结果只有 DHPLC 技术从 65 个样本中检测到了全部 58 种突变，检测结果与测序结果完全相符。这 58 种突变包括 38 种单碱基替换， 16 种碱基缺失， 3 种碱基插入和 1 种插入，缺失复合突变。这项研究证明了 DHPLC 技术发现各种基因突变的能力。最重要的是这些突变中的 40 （ 71% ）种是以前从未被报道过的，有可能逃脱了其它基因分型诊断方法的检测。这项研究结果为采用 DHPLC 技术作为分子诊断方法提供了有力的支持。在另外一项对整个囊性纤维化（ CF ）基因（ CFTR ）的筛查中， DHPLC 技术对 73 个 CF 病人的全部 CFTR 突变的检出率为 100% 。另外还有一些研究结果表明 DHPLC 技术的突变检测准确率达到或接近 100% 。这些受检基因包括： X- 连锁眼白化病（ OA1 ），威尔逊病（ ATP7B ），家族性腺瘤息肉病（ APC ），家族性癌症综合征（ PTEN, RET, VHL ），常染色体显性多囊性肾病（ PKD1, PKD2 ），血友病 A( 因子Ⅷ ) ，家族性高胆固醇血症（ LDLR ），黑色素瘤（ INK4A ），和退行性非综合征式遗传性耳聋（ GJB2 ）等。表 1 中所罗列的是最近利用 DHPLC 筛查突变的基因。 Stanford 基因组技术中心的网址 http://insertion.stanford.edu/dhplc_genes1.html , 提供全部或部分利用 DHPLC 筛查突变的基因列表，并提供相关疾病和引用文献的介绍。

DHPLC 技术最适于对含有大量外显子的基因，以及多基因疾病相关基因进行突变筛查。这些基因及其相关疾病的例子可在表 1 中找到，而更加全面的介绍可在 www.mutationdiscovery.com 中找到。该网站对遗传突变研究者们免费提供超过 8600 个人类基因的基因组 DNA 序列，以及在这些基因中已检测到的突变信息。在这些信息基础上，该网站还提供用于筛查这些突变的 PCR 和 DHPLC 的实验方案。

遗传异质性在很多复杂疾病中具有重要的意义，而 DHPLC 技术是研究遗传异质性疾病相关基因突变的理想方法。一项关于沙 - 马 - 图病（进行性神经性腓骨肌萎缩）（ CMT ）相关基因突变的研究报道是对上述观点的最完整的阐述 [9] 。作者将利用 DHPLC 技术对 168 个 CMT 患者进行的基因（ PMP22, MPZ, GJB1, EGR2 ）筛查结果与直接测序的结果进行了比较。所有以前报道过的突变 DHPLC 无一漏筛，而 DHPLC 检测出的某些新突变连测序技术都无法检测出。为了确定这些新突变，作者通过收集 DHPLC 异源双链部分，加大了样品中突变等位基因的含量，从而通过测序确定了突变类型。对于某些多表型疾病，如感觉神经性耳聋，色素性视网膜炎和外周神经疾病等， DHPLC 技术也是一种理想的方法，因为它们都有大量的疾病相关位点需要进行基因突变筛查。

DHPLC 突变检测技术的敏感性：

体细胞基因突变

直到不久以前，直接测序仍然被认为是突变检测的“金标准 ”。然而现在基因突变频率低于20%就很难用测序方法检测到，这已是公认的事实。 DHPLC 技术是通过区分同源和异源双链来进行突变检测的。这种方法与直接 DNA 测序相比更有利于突变等位基因的识别 。已有文献报道 DHPLC 技术可从待检样品中检测到占总基因量 0.5-5% 的突变等位基因，且实验重现性很好 。近来有两篇报道表明 DHPLC 技术可从发生低水平体细胞遗传镶嵌现象的结节状硬化患者标本中检测到 TSC1 和 TSC2 基因突变，而该种突变用测序法完全检测不到 。更深入的研究表明这种基因突变存在于 6-15% 的患者的外周血淋巴细胞中。

体细胞遗传镶嵌现象指的是在一个特定器官中出现具有不同遗传性状的多个体细胞群落。这种现象可由 DNA 突变， DNA 的修饰性改变，染色体异常或自发性遗传突变逆转等因素引起。这种现象含有孟德尔式和非孟德尔式基因异常，而它最典型的例子就存在于癌症的发生过程中。 Youssoufian 和 Pyeritz 在他们的文章中对这种遗传镶嵌现象进行了详尽的总结 。 漏筛这种遗传镶嵌现象所造成的突变会导致基因突变发生频率的报告不准确，也会使遗传诊断发生疏漏。而这种现象的筛查对检测肿瘤组织中的体细胞基因突变和异种组织线粒体 DNA 中的致病基因突变也是非常重要的。近来有报道表明利用 DHPLC 技术可从白血病患者 P53 基因的外显子中筛查出突变频率低于 3% 的基因突变 。而在一项利用 DHPLC 技术对整个线粒体基因组进行突变筛查的研究中，频率高于 0.5% 的突变都可被检出 。还有许多检测各种肿瘤癌基因突变的文献报道也对 DHPLC 技术的敏感性给予了肯定。

虽然肿瘤是一种遗传病这种观点早已是公认的事实，但特定的 DNA 遗传改变和抗癌药物疗效之间存在关联才刚刚被认识到。未知突变的检测对于了解上述的关联至关重要，而 DHPLC 正是实现这个目的合适的技术。例如在对肿瘤发病机制的研究中，在新发现的基因中寻找突变非常重要。 Lipkin 在文章 中报道利用 DHPLC 技术，发现一种新的 DNA 错配修复基因 MLH3 在 25% 的受检结肠癌患者样品中发生了基因突变，而此前的两项利用其它敏感性和准确性都较低的方法进行的研究都认为 MLH3 与结肠癌易感性无关。由此可见， DHPLC 技术的敏感性和准确性确实拥有较大的优势。而 Smith 在他的文献 中报道了利用 DHPLC 技术对已知和未知的疾病相关基因进行突变筛查的情况。在这项研究中， DHPLC 技术被用来筛查绝大部分 APC 和 P53 基因，因为突变有可能分散在这些基因中。实验结果表明 DHPLC 技术作为一种基因突变预筛手段，可以极大地提高测序的效率。